外显子组测序揭示罕见癌症基因突变特征，发现新药物靶点 | 外显子组专题

文章名：阴茎鳞状细胞癌的全外显子组测序揭示了与头颈部鳞状细胞癌相似的新的预后分类和药物靶点

发表杂志：Clin Cancer Res（医学一区 肿瘤学）

杂志影响因子：8.911

发表时间：2021

1.研究背景

阴茎鳞状细胞癌（PSCC）在美国是一种罕见的癌症，每年约有2000例新病例和400例死亡。PSCC的发病率在全球发展中国家明显较高。人类乳头瘤病毒（HPV）是全球约30%-50% PSCC病例的已知病因。目前对局部晚期PSCC的治疗方法是采用以铂类为基础的新辅助化疗，然后进行手术巩固，但只有不到30%的局部晚期PSCC患者能够获得长期疾病控制；不幸的是，大多数患者会出现疾病进展或复发。一线化疗后的PSCC复发与较差的生存期相关，估计中位总生存期（OS）为5个月，且治疗选择非常有限。因此，进行分子研究以确定与PSCC相关的复发性改变，以及对这种罕见疾病的潜在分子靶点进行药物开发是很重要的。

目前研究PSCC基因组图谱的证据受到以下因素的限制：样本量小、HPV阳性病例有限以及不同的分子检测方法。之前的研究已经确定了阴茎肿瘤发生的两种不同途径，一种与HPV相关，另一种与HPV无关。此外，在PSCCC中，只有少数已知的抑癌基因的点突变被报道，包括TP53、CDKN2A和PIK3CA。因此，尚不能很好地确定其他基因在多大程度上导致了该疾病，从而构成了潜在治疗探索的额外靶点。

因此，作者迫切需要基于对疾病生物学的深入认识来识别新疗法。其他研究已经发现了来自不同解剖部位的鳞状细胞癌（SCC）之间的分子聚合的有力证据，但这在PSCC中尚未被探索。在本研究中，作者对34个PSCC进行了迄今最大的全外显子组分析，以探索这种罕见癌症的遗传学。

2.实验设计

PSCC以及匹配的34例前瞻性随访患者的正常阴茎组织，进行基因组WES和人乳头瘤病毒检测。作者通过两种方法进行了肿瘤突变特征估计，首先是识别APOBEC相关突变富集，其次是根据突变模式与癌症突变特征中体细胞突变的关联对其进行分类。作者在癌症基因组图谱研究中对PSCC队列和其他SCC进行了广泛的基因组比较。

3.实验结果

作者发现大多数PSCC样本显示Notch通路富集（n=24，70.6%）改变，与头颈部鳞状细胞癌（HNSC）相当。PSCC突变特征与HNSC特征最具可比性。PSCC样本显示了两种不同突变特征的富集，突变模式1（MP1）与AID/APOBEC的致癌活性有关，突变模式2（MP2）与DNA错配修复缺陷和微卫星不稳定性有关。MP1富集与肿瘤突变负荷增加呈正相关（TMB；CC， 0.71；P ＜0.0001），与MP2组患者相比，其生存率明显更差。作者发现，与未富集APOBEC的PSCC亚群相比，富集APOBEC相关突变特征的PSCC亚群（38%）具有明显更高的TMB和更差的总生存率。

4.实验结论

本研究发现了新的药物靶点以及PSCC和HNSC之间突变特征的相似性，具有潜在的临床意义。

5.结论解析

图1A描述了PSCC中30个最常见的外显子突变，其中2例患者（14T和27T）突变数目明显高于其它样本被归类为超突变型（图1B）。以这两个超突变型样本暴雨图可见，PSCC患者中最常见的SNVs为C>T（平均48%），其次为C>G（16.5%）、C>A（15.4%）、T>C（12.1%）、T>G（4.2%）和T>A（3.8%）（图1C）。PSCC中以Notch通路受累最常见，其中70.6%（24例）的PSCC样本存在17种Notch基因中至少1种的突变，包括Notch1（15例，44.1%）、EP300（5例，14.7%）和FBXW7（5例，14.7%）（图1 D）。

图1 PSCC的常见突变基因的突变特征

作者根据5’和3’碱基的单碱基替换频率估算了每例患者的突变模式，并对96种不同的突变类型进行了分类。通过进行遗传分析，作者在PSCC样本中发现了两种不同的突变模式，作者称之为突变模式1 （MP1）和突变模式2 （MP2）（图2A和B）。这两种突变模式在每个个体样本中的富集情况见图2C。MP1在9例PSCC中表达最多，MP2在25例PSCC中表达最多。将这些突变模式与COSMIC数据库中的已知癌症突变进行比较。评分表明PSCC突变模式和COSMIC特征之间最接近的匹配（图2D）。MP1与SBS2、SBS13和SBS7a 显示出高度关联，其中SBS2被认为是AID/APOBEC胞苷脱氨酶家族活性的病因。有趣的是，MP1富集与TMB增加呈正相关（CC=0.71；P<0.0001）。SBS7a在与阳光暴露相关的肿瘤中常见，并可能由紫外线辐射引起。MP2与DNA错配修复系统缺陷、微卫星不稳定性和小插入缺失相关的SBS6、SBS15相关性最高。考虑到MP1与与APOBEC胞苷脱氨酶活性相关的突变特征高度相关，作者还评估了APOBEC相关突变模式的富集，算法考虑TpCpW（其中W可能是腺嘌呤或胸腺嘧啶）的变化率作为APOBEC相关突变过程的标志物。作者估计38% （n=13）的PSCC样本具有丰富的APOBEC相关突变特征（图2C），并支持PSCC中存在这一子集，这些APOBEC富集样本的TMB显著高于非APOBEC富集样本。

图2（上） MP1与MP2特征分析

图2E显示MP1富集与较差的生存率显著相关。由于MP1评分通过与APOBEC胞苷脱氨酶活性相关的突变特征高度富集，因此还探索了这些样本中APOBEC评分的影响。高APOBEC评分与死亡率（P < 0.009）和淋巴结转移（P < 0.024）显著相关。单因素Cox回归分析显示，APOBEC评分升高与不良生存率显著相关。将样本分为APOBEC富集样本和非APOBEC样本时，作者观察到在APOBEC富集样本中，生存期较差的趋势，但无统计学显著性。

图2（下） 生存率比较分析

为了与其它鳞状癌进行特征比较，作者选择6种TCGA数据库中鳞状癌数据进行比较分析，包含HNSC （n=501）、膀胱（BLCA） （n=47）、食管（ESCA） （n=95）、宫颈（CESC） （n=241）和LUSC （n=471）鳞状细胞癌比较。所有分析的鳞状细胞癌中，PSCC肿瘤的TMB是最低的，显著低于调查的任何其他鳞状细胞癌（图3A）。将PSCC肿瘤的TMB与其他实体恶性肿瘤（包括来自上述部位的非鳞状肿瘤）和淋巴瘤进行比较时，作者发现PSCC在TCGA测序的肿瘤中具有中间TMB（补充图S3）。从TCGA数据库中鳞癌中平均突变频率最高的30个基因中，PSCC队列中有22个基因的突变频率相似（73.3%；补充表S4）。PSCC和TCGA鳞状细胞队列之间发生差异突变的其他8个基因是TP53、TTN、CSMD3、RYR2、KMT2D、FAT1、CDKN2A和Notch1（图3B）。此外，PSCC显示KDM6A、CASP8、LAMA1、DNAH6和MUC2基因突变，这些基因在大多数TCGA鳞状细胞肿瘤中不常发生突变（图3B）。与膀胱癌、子宫颈癌、食管癌、肺鳞癌相比，PSCC患者Notch1突变频率增加。同样，FAT1突变在PSCC中的频率高于子宫颈癌和食管癌，CDKN2A突变在PSCC中的频率高于子宫颈癌；DNAH6在PSCC中的表达高于HNSC， CASP8在PSCC中的表达高于食管癌和肺鳞状细胞癌。TP53， TTN， CSND3， RYR2和KMT2D在PSCC样本中的频率显著较低。此外，作者比较了DDR （BRCA1、BRCA2、ARID1A、ATR、CHEK2、PARP1、FANCA、PALB2和RAD51）基因在PSCC和鳞状细胞癌队列中的突变率。PSCC中DDR基因突变的患者比例较高（n=8，23.5%），与肺鳞状细胞癌（n=116，24.6%）和膀胱癌（n=13，27.7%）相似。HNSC （n=85例，17%），食管癌（n=13例，13.7%）和宫颈癌（n=44例，18.3%）队列显示出较低的DDR突变患者数量，但与PSCC队列无显著差异。

作者又进一步评估了PSCC中96种突变类型的频率。通过进行表型分析，作者估计了6个鳞状细胞队列中的3种不同的突变模式，作者将其命名为Sq-MP1， Sq-MP2和Sq-MP3。PSCC样本主要富集Sq-MP2 （n=23，67.6%），其次是Sq-MP1 （n=8，23.5%）和Sq-MP3 （n=3，8%；图3 c）。每个特征在PSCC和肺鳞状细胞癌之间的分布有显著差异（P <0.0001）、膀胱癌（P=0.006）和宫颈癌（P <0.0001）。然而，PSCC和HNSC （P < 0.208）和食管癌（P < 0.387）之间没有显著差异，表明这三个队列之间有相似的突变特征。如前所述，作者通过评估APOBEC突变特征估计值进一步比较了这些队列的突变背景（图3D）。PSCC与膀胱癌（P=0.0002）和宫颈癌（P <0.0001）的队列显示出APOBEC1相关突变的高度富集。当PSCC与LUSC、食管癌和HNSC队列比较时，没有观察到差异。

图3 PSCCs与TCGA鳞状癌的基因组比较

辅助材料S3

在治疗选择有限的罕见癌症中，全外显子分析为PSCC的生物学提供了一些新的见解，并强调了PSCC与HNSC的相似性。作者的目标是利用这项技术来获得对这种罕见且致命癌症的新治疗策略的潜在见解。在这方面，虽然作者的样本量很小，但它代表了使用WES方法报告的最大的PSCC队列。作者还在HPV状态和基因型的背景下分析了数据。作者研究的另一个局限性是，尽管作者的样本反映了就诊时的分期，但只有有限的数量为晚期，并且除了鳞状细胞之外没有其他组织学类型的阴茎癌，这限制了作者结论的泛化。

综上所述，作者对PSCC基因组学的系统分析发现，超过一半的PSCC样本涉及Notch信号失调通路，显示Notch通路的富集改变。这对未来的临床研究很有意义，因为最近的研究在67%的人类HNSC病例中发现了类似的致癌突变，这些突变集中在Notch信号通路上。因此，Notch失活是PSCC和HNSC的标志。上述发现为正在进行和未来使用PI3K/mTOR抑制剂治疗Notch1突变的HNSC患者的临床试验提供了潜在的理论基础，从而可能包括PSCC患者和HNSC队列。

6.结果讨论

在本研究中，作者使用的WES覆盖了人类基因组的大部分外显子区域，覆盖了20000多个人类基因。与Feber及其同事使用的一种被称为“全面基因组分析”的目标测序技术相比，后者覆盖了大约300个人类基因的变化，仅占作者研究中基因组覆盖的1.5%。除了覆盖较少的基因组外，这些目标测序方法中包括的一些基因甚至未被该检测完全覆盖，从而未能充分代表某些基因的突变频率。另一方面，Feber及其同事进行了全外显子组分析，然而，需要强调的是，这些研究之间存在重要的技术差异。该研究中产生的平均测序深度为141，而在feb及其同事的研究中，平均测序深度仅为60。产生的测序数据量的这一差异可能对最终的突变谱结果产生重要影响。

在他们的研究中，每例患者的平均突变率是30，这比作者发现的每例患者平均125.7个突变要低得多。即使调整每Mb测序突变率，其突变率为1.78/ Mb，低于本研究的1.96/ Mb。这些差异也可以在基因水平上凸显出来。在他们的分析中，最常见的突变基因FAT1和TP53仅影响27个测序样本中的4个，这仅占他们病例的14.8%。另一方面，作者队列中最常见的突变基因FAT1和TP53影响了35%的样本。这些差异表明，他们研究中的突变频率可能被低估。

7.未来展望

为了验证和更好地描述这些发现，未来需要检查更大的队列，结合功能分子分析和利用最近可用的临床前模型。这项工作是向该领域提供新的治疗策略的基本原理迈出的第一步。

相关阅读

点击下方图片进入云平台资料汇总：

所见即所得，绘图高规格联川云平台，让科研更自由